Haplotagging
Eine neuartige und schnelle Methode zur Markierung und Sequenzierung von Haplotypen
Wir entwickelten diese neuartige Technologie, weil wir Folgendes erreichen wollten: erstens eine große Anzahl von Proben sequenzieren, zweitens eine hohe molekulare Auflösung erreichen und drittens dies mit einem angemessenen Budget erzielen.
Das Problem mit bestehenden Sequenzierungstechniken
Wir haben festgestellt, dass bisher vorhandene Sequenzierungstechniken für uns nicht zielführend sind. Die Kurzzeitsequenzierung von Illumina ist kostengünstig und sehr genau. Aber das Genom wird dabei in winzige Teile zerlegt, so dass Informationen zum haploiden Genotyp verloren gehen. Daneben besteht die Möglichkeit der Linked-Read-Sequenzierung, die den Vorteil der Einfachheit und Genauigkeit der Short-Read-Sequenzierung mit der Haplotyp-Information der Long-Read-Sequenzierung kombiniert.
Die bestehenden kommerziellen Optionen sind jedoch sehr teuer und haben einen sehr geringen Datendurchsatz. Wir brauchten einen neuen Ansatz.
Unsere Lösung: Haplotagging - eine schnelle und einfache Technik für Linked-Read-Sequenzierung
Eine Reihe von Veröffentlichungen über Continguity-Preserving Tagmentation Sequencing (CPTseq) von Jay Shendure (UW Seattle) und Frank Steemers (Illumina) lieferte die Antwort (Amini et al., Nat Biotech, 2014; Zhang et al., Nat Biotech, 2017). Sie zeigen eine völlig neue Art des molekularen Barcodings, das sich von der vormals führenden kommerziellen Methode von 10X Genomics unterschied. Im Gegensatz zur Chromium-Plattform von 10X Genomics, die einzelne DNA-Fragmente ("Moleküle") in mikrofluidischen Tröpfchen isoliert, nutzt CPTseq Tn5, ein Transposase-Protein, das in der Lage ist, molekulare Bindeglieder in einer einzigen enzymatischen Reaktion auf DNA-Sequenzen zu übertragen.
Dies ist insofern von großer Bedeutung, als Tn5 bereits unter dem Namen "Nextera" verwendet wird, um die Bereitstellung von Illumina-Sequenzierungsbibliotheken zu einem unkomplizierten Hochdurchsatzverfahren zu machen. In Zhang et al. (2017) wurde außerdem gezeigt, dass sich die DNA in einem Reagenzglas um Mikrokügelchen in Lösung wickelt.
Unabhängig davon haben wir in unserem Labor auch einen einfachen Weg gefunden, um Tn5-Transpase-Komplexe (sog. Transposomen) an Mikrokügelchen zu binden. Wenn wir also all diese verschiedenen Komponenten zusammenbringen...was wäre, wenn wir jedes Mikrokügelchen, das Tn5-Transposomen trägt, einzeln mit einem Strichcode versehen könnten? Mit anderen Worten: Wenn wir Tn5-Transposomen auf einzeln barcodierte Kügelchen aufbringen, können wir auf einfache Weise eine entsprechende Sequenzierung durchführen.
Es hat funktioniert
Wir haben in Meier et al., PNAS, 2021, gezeigt, dass es funktioniert! Wir können nicht nur Linked-Read-Bibliotheken erstellen und Varianten in einzelne, megabasierte Phasenblöcke aufteilen, wie dies bei der 10X Chromium-Plattform der Fall ist. Da es sich jetzt um eine zehnminütige enzymatische Reaktion mit PCR handelt, haben wir jetzt Tausende von Haplotagging-Bibliotheken von Menschen, Mäusen, Schmetterlingen und anderen Organismen erstellt.
Dadurch können wir Daten des Erbguts von Lebewesen in einem Umfang und einer Qualität erstellen, wie es sie noch nie gegeben hat.
Mit Hilfe von Haplotagging können wir Gene kartieren, Selektionsmerkmale erkennen, die Aufspaltung von Haplotypen verfolgen und auch große strukturelle Veränderungen wie Inversionen nachweisen. All dies geschieht zu minimalen Kosten (in vielerlei Hinsicht ist es sogar billiger als die Herstellung von Standard-TruSeq-Bibliotheken), aber mit allen analytischen Vorteilen.
Publikationen
- 2021 Meier, J.I.*, Salazar, P.A.*, Kučka, M.*, Davies, R.W., Dréau, A., Aldás, I., Box-Power, O., Nadeau, N., Bridle, J.R., Rolian, C.P., Barton, N.H., McMillan, W.O., Jiggins, C.D.†, Chan, Y.F.† Haplotype tagging reveals parallel formation of hybrid races in two butterfly species. (* co-first authors; † co-last authors). PNAS, doi: 10.1073/pnas.2015005118
- This paper presents haplotagging and shows its use in mice and a parallel Heliconius butterfly hybrid zone in Ecuador.
- 2021 Davies, R.W, Kučka, M., Su, D., Shi, S., Flanagan, M., Cunniff, C.M., Chan, Y.F.*, Myers, S.*, Rapid genotype imputation from sequence with reference panels. (* co-last authors). Nature Genetics, doi: 10.1038/s41588-021-00877-0
- This paper presents QUILT, a rapid and accurate imputation package by Robbie Davies (Oxford) based on Gibbs sampler.
- 2021 Song, J.H.T., R. L. Grant, V. C. Behrens, M. Kučka, G. A. R. Kingman, V. Soltys, Y.F. Chan, D. M. Kingsley. Genetic studies of human-chimpanzee divergence using stem cell fusions. PNAS, 118(51) e2117557118, doi: 10.1073/pnas.2117557118
- We used haplotagging here to detect within and cross-species mitotic recombination rates in the allotetraploid cells as in Dreau et al., 2019, Nat Comm, doi: 10.1038/s41467-019-12210-9
Protokolle
Den zugehörigen analytischen Code finden Sie in unseren Github-Repositories hier und hier. Wir sind aktiv dabei, Versuchsprotokolle zusammenzustellen. Hier sind ein paar:
Haplotagging (mit vorgefertigten Beads)